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多聚左旋赖氨酸对大脑皮层星形胶质细胞体外培养的影响

2016-07-08 15:08　来源: 互联网作者：何玲刘露陈国俊浏览次数 4116

2.3 免疫荧光鉴定AS及不同浓度PLL包被组AS纯度的比较
　　第三代AS，倒置显微镜下可见细胞形态不规则，胞浆丰富且密度较低，核/浆比例小，胞核呈椭圆形，偏向于胞体一侧；GFAP细胞免疫荧光法鉴定，激光共聚集显微镜下见AS胞质呈绿色荧光，核蓝染，见图3。各PLL包被组AS纯化率见图4，100 μg/mL PLL包被组纯化率[（90.00±0.53）%]低于对照组[（96.00±0.63）%]、25 μg/mL PLL包被组[（97.00±0.57）%]、50 μg/mL PLL包被组[（98.00±0.77）%]，差异均有统计学意义（P < 0.05）；对照组、25 μg/mL PLL包被组、50 μg/mL PLL包被组AS纯化率两两比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。
　　2.4 AS传代情况及不同浓度PLL包被组第三代AS细胞活性
　　传代后细胞生长速度较原代快，第一代及第二代AS，各PLL包被组细胞均能在4 d进入对数生长期，6 d达85%～90%的融合度。传至第三代，对照组细胞贴壁后生长缓慢，各PLL包被组细胞仍保持前两代的增殖速度。各PLL包被组第三代AS在第2、4、6天活性比较见图5、表1。
　　3 讨论
　　体外培养AS是进行神经科学研究的基础。本实验中选取出生1～3 d的新生鼠，一方面因为出生后的神经元不再分裂，从而可减少神经元的污染[15]，另一方面因出生1～3 d的新生鼠，脑沟脑回形成不明显，其脑膜及血管较易剥离。实验中尽可能剥离血管及脑膜，是减少成纤维细胞污染的关键环节[16]。
　　预包被PLL后，细胞贴壁率高且原代生长周期少于无PLL包被组，在8～9 d即呈“毛毡毯”样铺满底层，与文献中提到的较适宜的时间相一致[17]。原代细胞在前4 d生长缓慢，所需营养相对较少，故本实验接种血清浓度为10%，以减少对细胞贴壁的影响，3 d后第1次换液，则改为15%血清浓度培养细胞，以满足快速增殖细胞的营养。
　　激光共聚焦显微镜下清楚的观察到第三代AS的细胞形态，与其他文献中报道的AS形态一致[18]。通过荧光显微镜计算各PLL包被组细胞AS纯度，除100 μg/mL PLL包被组外，其余三组细胞均能达95%的纯化率，其主要原因考虑为高浓度PLL让原代大脑皮层各类细胞均牢固贴壁，导致在振荡环节中，AS单层上的杂细胞不易被去除。有文献报道[19]，在每次传代前均进入摇床，加速振荡及增加传代次数也可进一步去除杂细胞。
　　利用AS较强的增殖活性，多次传代可去除少突胶质细胞和小胶质细胞等细胞，通常用于实验的AS为传至第三代及第四代的细胞[20]。本实验研究发现，对照组细胞前2次传代，尚能保持和其他PLL包被组的传代速率，在传至第三代时，对照组细胞增殖缓慢且活性较低。因此，通过包被PLL来促进细胞早期贴壁，对传代后AS细胞活性有着重要的作用。
　　本研究结果表明，PLL预包被能提高AS贴壁和生长状态，其中25～50 μg/mL PLL包被浓度为适宜浓度，无PLL包被可影响细胞的存活率及活性，较大浓度PLL包被可影响AS的纯化率。
　　[参考文献]
　　[1] Chung W，Clarke LE，Wang GX，et al. Astrocytes mediate synapse elimination through MEGF10 and MERTK pathways [J]. Nature，2013，504（7480）：394-400.

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