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多聚左旋赖氨酸对大脑皮层星形胶质细胞体外培养的影响

2016-07-08 15:08　来源: 互联网作者：何玲刘露陈国俊浏览次数 4117

　　1.3.3 台盼蓝活细胞计数检测原代各PLL包被组细胞的贴壁率培养3 d后的细胞，消化获得单细胞悬液，0.4%台盼蓝染色后计数细胞，每孔重复3次，取平均值。贴壁率=（贴壁细胞数/接种细胞数）×100%。
　　1.3.4 CCK检测法绘制原代细胞生长曲线初次分离的原代细胞，按密度为1×104个/孔接种于96孔板中。分别在2、4、6、8、10、12 d，加入10 μL的CCK-8溶液，混匀，孵育2 h后，后用酶标仪在450 nm处扫描吸光度，记录OD450值。连续12 d于同一时间点进行观察，每组设3个复孔。
　　1.3.5 传代培养过夜振荡细胞予0.25%的胰酶消化，按5×104个/mL接种后放入敷箱中孵育达85%融合度后再次传代。
　　1.3.6 免疫荧光鉴定 GFAP是AS的标志性蛋白[14]，第三代AS以2.5×104个/mL接种于放有细胞爬片的24孔板中，孵育48 h，4%多聚甲醛4℃固定30 min，山羊血清37℃封闭1 h，滴加一抗兔抗大鼠GFAP多抗（1∶100），4℃过夜，另设PBS代替一抗作为阴性对照。次日，1∶200山羊抗兔FITC荧光二抗，37℃避光孵育1 h，PBS冲洗3次，每次5 min，予DAPI复染细胞核3 min。抗荧光淬灭液封片，激光共聚焦显微镜观察AS形态；在荧光显微镜下观察，每组各取4张爬片，每张爬片4个象限分别随机选取3个200倍视野计数，取均值，计算绿色荧光阳性细胞百分比，即AS的纯化率。
　　1.4 传代情况及CCK法检测不同浓度PLL包被组第三代AS细胞活性
　　同样用CCK法检测传至第三代各PLL包被组细胞活性，每2天检测1次，连续6 d于同一时间点进行观察，每组设3个复孔。
　　1.5 统计学方法
　　采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，两组间比较采用t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；多组间比较采用单因素方差分析；采用Student-Neuman-Keuls （SNK）法进行多重比较；以P < 0.05为差异有统计学意义。
　　2 结果
　　2.1 原代细胞贴壁率
　　对照组细胞贴壁率[（75.15±0.07）%]显低于25 μg/mL PLL包被组[（91.87±0.10）%]、50 μg/mL PLL包被组[（94.44±0.07）%]、100 μg/mL PLL包被组[（97.79±0.11）%]，差异均有高度统计学意义（P < 0.01）；25 μg/mL PLL包被组细胞贴壁率与50 μg/mL PLL包被组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）；100 μg/mL PLL包被组贴壁率最高，与25 μg/mL PLL包被组及50 μg/mL PLL包被组比较，差异均有统计学意义（P < 0.05），提示细胞贴壁率随PLL包被浓度的升高而增大。
　　2.2 原代培养生长情况及各组细胞生长曲线
　　初次分离的AS接种后24 h后即可见折光度较好的贴壁细胞，接种后4 d内生长缓慢，第6天，25 μg/mL PLL包被组、50 μg/mL PLL包被组、100 μg/mL PLL包被组细胞进入对数生长期。而对照组在第8天左右进入对数生长期，各PLL包被组细胞生长曲线见图1。接种后8～12 d，镜下见AS呈“毛毡毯”样，处于底层，其他类型细胞呈点状分布在该层上。经摇床过夜振荡，AS与其他细胞分离，以梭状及多角形为主，细胞边缘较模糊，突起不明显。见图2。

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